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17302193538牛胰高血糖素（GC）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定牛血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中胰高血糖素（GC）的含量。
實驗原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中牛胰高血糖素（GC）水平。用純化的牛胰高血糖素（GC）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入牛胰高血糖素（GC），再與HRP標記的檢測抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的牛胰高血糖素（GC）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中牛胰高血糖素（GC）含量。
試劑盒組成：
試劑盒組成
48孔配置
96孔配置
保存
說明書
1份
1份
封板膜
2片
2片
密封袋
1個
1個
酶標包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
標準品
0.3ml×6管
0.3ml×6管
2-8℃保存
酶標試劑
5 ml×1瓶
10 ml×1瓶
2-8℃保存
樣品稀釋液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑A液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑B液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
終止液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
20×濃縮洗滌液
15ml×1瓶
25ml×1瓶
2-8℃保存
注：標準品濃度依次為：400、200、100、50、25、0 pg/mL.
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
標準品的加樣：設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；。
加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
注意事項：
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
底物請避光保存。
嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD
值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋
倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。
2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% 。
檢測范圍：
12.5 pg/mL - 400 pg/mL
靈敏度：
zui低檢測濃度小于1.0 pg/mL
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存： 2-8℃。
2．有效期： 6個月
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