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17302193538RJ11723人γ干擾素(IFN-γ)ELISA檢測試劑盒
干擾素（ IFN-γ , 又稱 II 型干擾素或免疫干擾素）是一種主要由T淋巴細胞 和自然殺傷細胞產生的細胞因子。該蛋白與IFN-β或各種IFN-α家族蛋白沒 有明顯的同源性。成熟的 IFN-γ以非共價連接的同質體存在。人類IFN-γ具 有高度的物種特異性 ，只在人類和靈長類細胞中具有生物活性。IFN-γ最初 是基于其抗病毒活性而被定性的。該蛋白還發揮抗增殖、免疫調節和促進炎 癥的活性 ， 因此在宿主防御機制中很重要。IFN-γ誘導細胞因子的產生 ，上 調 I 類和 II 類 MHC 抗原、Fc 受體和白細胞粘附分子的表達。它調節巨 噬細胞的效應功能 ，影響異型轉換并增強 B 細胞分泌免疫球蛋白的能力。
本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（ ELISA） 。往預先包被有人 γ干擾素(IFN-γ)捕獲抗體的微孔中 ，依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢 測抗體 ，HRP酶結合物 ， 中間經過溫育和洗滌 ，用底物TMB顯色 ，TMB在過 氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色 ，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色 的深淺和樣本中的人γ干擾素(IFN-γ)呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測 定吸光度（ OD值） ，計算樣本濃度。
靈敏度：0.54pg/mL
特異性：可檢測樣本中人的IFN-γ , 且與其類似物無明顯交叉反應
名稱 | 5×96孔配置 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
預包被 96 孔酶標板 Pre-coated Assay Plate | 5×8 孔×12 條 | 8 孔×12 條 | 8 孔×6 條 | 無 |
標準品 Standard | 10 支 | 2 支 | 1 支 | 按說明書 進行稀釋 |
通用稀釋液 Universal Diluent | 10×20mL | 2×20mL | 1×20mL | 無 |
濃縮生物素化檢抗 100× Biotin-antibody (100×) | 5×120μL | 120μL | 60μL | 按說明書 進行稀釋 |
濃縮酶結合物 100× Streptavidin-HRP (100×) | 5×120μL | 120μL | 60μL | 按說明書 進行稀釋 |
20×洗滌液 Wash Buffer (20×) | 10×10mL | 2×10mL | 1×10mL | 按說明書 進行稀釋 |
底物（ TMB） TMB Substrate | 5×10mL |
10mL |
5mL | 無 |
終止液 Stop Solution | 5×6mL |
6mL |
3mL | 無 |
封板膜 Plate Sealer | 20 張 | 4 張 | 4 張 | 無 |
說明書 Instruction Manual | 1 份 | 1 份 | 1 份 | 無 |
1. 試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍 ，建議實驗前通過相 關文獻預估樣本中待測物的濃度并通過預實驗確定樣本的實際濃度。如 果樣本中待測物濃度過高或過低 ，請對樣本做適當的稀釋或濃縮。
2. 若所檢樣本不在說明書所列樣本類型之中 ，建議做預實驗驗證其檢測有 效性。
3. 血清 ：將收集于血清分離管的全血樣本在室溫放置2小時或2-8℃過夜 ， 然后1000×g離心20分鐘 ，取上清即可 ，或將上清置于-20℃或-80℃保存， 但應避免反復凍融。
4. 血漿 ：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集樣本 ，并將樣本在采集后的30分 鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘 ，取上清即可檢測 ，或將上清置于-20℃ 或-80℃保存 ，但應避免反復凍融。
5. 組織勻漿 ：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織 ，去除殘留血液（勻 漿中裂解的紅細胞會影響檢測結果） ，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組 織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比 ，比如1g的組織樣本對應 9mL的PBS ，具體體積可根據實驗需要適當調整 ，并做好記錄。推薦在 PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中 ，于冰上充分研磨或勻漿 機研磨。為了進一步裂解組織細胞 ，可以對勻漿液進行超聲破碎 ，或反 復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~ 10分鐘 ，取上清檢測。
6. 細胞培養物上清 ：請1000×g離心20分鐘 ，取上清即可檢測 ，或將上清
置于-20℃或-80℃保存 ，但應避免反復凍融。
7. 細胞裂解液 ：貼壁細胞用預冷PBS輕輕清洗 ，然后用胰蛋白酶消化，
1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞 用預冷PBS清洗3次 ，每1×10^6個細胞中加入150-200μL PBS重懸（推 薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當減少PBS體積）并通 過反復凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃ , 1500×g離心10分鐘， 取上清檢測。
8. 其它生物樣本： 1000×g離心20分鐘 ，取上清即可檢測。
9. 樣本外觀 ：樣本應清澈透明 ，懸浮物應離心去除。
10. 樣本保存 ：樣本收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃ , 若不能及時 檢測 ，請按一次使用量分裝 ，凍存于-20℃（ 1個月內檢測） ，或-80℃ （ 6個月內檢測） ，避免反復凍融 ，樣本溶血會影響最后檢測結果 ， 因 此溶血樣本不宜進行此項檢測。
請提前預估樣本的濃度范圍 ，如果您的檢測樣本需要稀釋 ，參考稀釋方案如下：
稀釋 100 倍：一步稀釋。取 5μL 樣本到 495μL 通用稀釋液內 ，做 100 倍稀釋；
稀釋 1000 倍 ：兩步稀釋。取 5μL 樣本到 95μL 通用稀釋液內 ，做 20 倍稀釋 ， 再取 5μL 20 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ， 做 50 倍稀釋 ， 總共稀釋 1000 倍；
稀釋 100000 倍 ：三步稀釋。取 5μL 樣本到 195μL 通用稀釋液內 ，做 40 倍稀 釋 ，再取 5μL 40 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，最后取 5 μL 2000 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋 100000 倍；
每步稀釋時取液量不少于 3μL ，稀釋倍數不超過 100 倍。每步稀釋都需混合均 勻 ，避免起泡。
1. 請提前從冰箱中取出試劑盒 ，平衡至室溫。
2. 標準品梯度工作液配制：加入 1mL 通用稀釋液至凍干標準品中 ，靜置15 分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為100pg/mL)，然后按照以下濃度：
100pg/mL、 50pg/mL、25pg/mL、 12.5pg/mL、6.25pg/mL、3. 12pg/mL、
1.56pg/mL、0pg/mL進行稀釋。
倍比稀釋方法 ：取7支EP管 ，每管中加入500μL通用稀釋液, 100pg/mL 的 標準品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成50pg/mL 的標準品工 作液 ，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔 ，不需要再 從倒數第二管中吸取液體 ，具體如下圖。
3. 生物素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將100×濃縮生物素化檢抗于 1000×g離心1分鐘 ，以通用稀釋液將100×濃縮生物素化檢抗稀釋成1×工 作濃度(例： 10μL濃縮液+990μL通用稀釋液) ，現配現用。
4. 酶結合物工作液配制 ：使用前15分鐘將100×濃縮酶結合物于1000×g離 心1分鐘 ，以通用稀釋液將100×濃縮酶結合物稀釋成1×工作濃度(例： 10 μL濃縮液+990μL通用稀釋液) ，現配現用。
5. 1×洗滌液配制：取10mL 20×洗滌液到190mL蒸餾水中（從冰箱中取出的 濃縮洗滌液可能有結晶 ，屬于正常現象 ，可放置室溫 ，待結晶溶解 后再配制)。
操作步驟：
1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條 ，剩余板條用自封袋密封 放回4℃。
2. 加樣 ：分別將樣本或不同濃度標準品按照100μL每孔加入相應孔中 ，空 白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。（建議：
將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標板內測試。從而減 少基質效應對測試結果的影響 ，最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋 倍數。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設立復孔）。
3. 加生物素化檢抗 ：取出酶標板 ，棄去液體 ，不用洗滌。每孔直接加入
100μL生物素化檢抗工作液 ，蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。
4. 洗板 ：棄去液體 ，每孔加入300μL 1x洗滌液 ，靜置1分鐘 ，甩去洗滌液， 吸水紙上拍干 ，如此重復洗板3次（也可用洗板機洗板）。
5. 加酶結合物工作液 ：每孔加入100μL酶結合物工作液 ，蓋上封板膜后 37℃溫育30分鐘。
6. 洗板 ：棄去液體按步驟4洗滌方法 ，洗板5次。
7. 加底物 ：每孔加入90μL底物(TMB) ，蓋上封板膜 ，37℃避光溫育15分鐘。
8. 加終止液 ：取出酶標板 ，每孔直接加入50μL終止液 ，立即在450nm波長 處測定各孔的OD值。
結果判斷：
1. 計算標準品和樣本復孔的平均 OD 值并減去空白孔的 OD 值作為校 正值。 以濃度為橫坐標 ，OD 值為縱坐標 ，在雙對數坐標紙上繪出四參 數邏輯函數的標準曲線。
2. 若樣本 OD 值高于標準曲線上限 ，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度 時乘以相應的稀釋倍數。
典型數據和參考曲線：
以下數據和曲線僅供參考 ，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。
濃度(pg/mL) | 100 | 50 | 25 | 12.5 | 6.25 | 3. 12 | 1.56 | 0 |
OD 值 | 2.36 | 1.78 | 1.23 | 0.79 | 0.46 | 0.29 | 0.17 | 0.09 |
校正 OD 值 | 2.27 | 1.69 | 1. 14 | 0.7 | 0.37 | 0.2 | 0.08 |
- |
注意 ：本圖僅供參考 ，應以每次實驗數據所繪制標準曲線計算樣本含量。
1. 重復性 ：板內變異系數小于 10% ，板間變異系數小于 10%。
2. 回收率 ：在選取的健康人血清、血漿和細胞培養上清中加入 3 個不同 濃度水平的人IFN-γ , 計算回收率。
樣本類型 | 范圍（ %） | 平均回收率（ %） |
血清(n=8) | 84-102 | 94 |
血漿(n=8) | 92-108 | 102 |
細胞培養上清(n=8) | 96-109 | 105 |
3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和細胞培養上清中加入
高濃度人IFN-γ , 在標準曲線動力學范圍內進行稀釋 ，評估線性。
稀釋比例 | 回收率（ %） | 血清 | 血漿 | 細胞培養上清 |
1 ：2 | 范圍 | 84-95 | 87-96 | 92-110 |
平均回收率 | 91 | 92 | 96 | |
1 ：4 | 范圍 | 89-103 | 87-108 | 106-115 |
平均回收率 | 94 | 98 | 108 |
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