Mouse IL-6 ELISA試劑盒原理說明

發(fā)布時間：2023-12-11 點擊次數(shù)：1236次

IL-6 簡介：白細胞介素 6（IL-6）是一種多功能蛋白，在宿主防御、急性期反應(yīng)、免疫反應(yīng)和造血中發(fā)揮重要作用。IL-6 由各種正常和轉(zhuǎn)化的細胞表達，包括 T 細胞、B 細胞、單核細胞/巨噬細胞、成纖維細胞、肝細胞、角質(zhì)細胞、星形細胞、血管內(nèi)皮細胞和各種腫瘤細胞。IL-6 的產(chǎn)生被許多信號上調(diào)，包括有絲分裂或抗原刺激、LPS、鈣離子團、IL-1、IL-2、IFN、TNF、PDGF 和病毒。IL-6 在單核細胞中的表達受到 IL-4 和 IL-13 的抑制。

實驗原理：本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被有小鼠白細胞介素 6（IL-6）捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢測抗體，HRP 酶結(jié)合物，中間經(jīng)過溫育和洗滌，用底物 TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠白細胞介素 6（IL-6）呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

試劑盒參數(shù)：需自備的設(shè)備及試劑： 1. 450±10nm 濾光片酶標儀 2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL. 3. Eppendorf 移液器. 4. 蒸餾水或去離子水. 5. 脫脂棉吸水紙. 6. 37℃恒溫箱. 8. 準備若干個標準品稀釋管.

樣本處理及要求：

1. 試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關(guān)文獻預(yù)估樣本中待測物的濃度并通過預(yù)實驗確定樣本的實際濃度情況。如果樣品中待測物濃度過高或過低，請對樣本做適當?shù)南♂尰驖饪s。

2. 若所檢樣本不在說明書所列樣本之中，建議做預(yù)實驗驗證其檢測有效性。

3. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時或 4℃過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4. 血漿：用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8℃1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5. 組織勻漿：用預(yù)冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié) 果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的 PBS（一般按 1:9 的重量體積比，比如 1g 的組織樣品對應(yīng) 9mL 的 PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于 5000×g 離心 5~10 分鐘，取上清檢測。

6. 細胞培養(yǎng)物上清：請 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

7. 其它生物標本：1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測。

8. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

9. 樣品保存：樣品收集后若在 1 周內(nèi)進行檢測的可保存于 4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1 個月內(nèi)檢測），或-80℃（6 個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。性能靈敏度 2.63pg/mL 檢測范圍 7.81-500pg/mL 特異性可檢測樣本中小鼠的 IL-6，且與其類似物無明顯交叉反應(yīng).

操作步驟： 1. 從室溫平衡 10 分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。

2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標準品按照 100μl 每孔加入相應(yīng)孔中，空白孔加入 100μL 通用稀釋液。蓋上封板膜后 37℃溫育 1 小時。（建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋 1 倍后再加入酶標板內(nèi)測試。從而減少基質(zhì)效應(yīng)對測試結(jié)果的誤差影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設(shè)立復(fù)孔）。

3. 加生物素化抗體：取出酶標板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液 100μL，蓋上封板膜后 37℃溫育 1 小時。

4. 洗板：棄去液體，每孔加入 300μL 1x 洗滌液，靜置 1 分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 3 次（也可用洗板機洗板）。

5. 加酶結(jié)合物工作液：每孔加入酶結(jié)合物工作液 100μL，蓋上封板膜后 37℃溫育 30 分鐘。

6. 洗板：棄去液體按步驟 4 洗滌方法，洗板 5 次。

7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育 15 分鐘。

8. 加終止液：取出酶標板，每孔直接加入終止液 50μL，立即在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。

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結(jié)果判斷：

1. 計算標準品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在雙對數(shù)坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線：

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標準曲線。

濃度（pg/mL)	500	250	125	62.5	31.25	15.62	7.81	0
OD值	2.28	1.24	0.67	0.35	0.19	0.14	0.11	0.09
校正OD值	2.19	1.15	0.58	0.26	0.1	0.05	0.02	-

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試劑盒性能：

1. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。

2. 回收率：在選取的健康小鼠血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入3個不同濃度水平的小鼠IL-6，計算回收率

樣本類型	范圍	平均回收率
血清（n=8)	87-101	96
血漿(n=8)	96-105	102
細胞培養(yǎng)上清(n=8)	98-108	105

3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康小鼠血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠IL-6，在標準曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。

稀釋比例	回收率（%）	血清	血漿	細胞培養(yǎng)上清
1：2	范圍（%）	86-95	88-96	90-110
1：2	平均回收率（%）	91	93	98
1：4	范圍（%）	89-103	87-108	107-115
1：4	平均回收率（%）	94	99	108

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